2019年10月1日，5-羥甲基化胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在糖尿病研究領域取得重要進展。2型糖尿?。═2D）的血管并發癥是導致2型糖尿病致殘致死的重要病因，一直缺乏一種無創便捷的臨床途徑實現血管并發癥的發生發展監測，達到早發現、早干預，以提高T2D病人的整體生活質量，減少衛生經濟負擔。

該研究入組了62例2型糖尿病病人，采用5hmC-Seal技術對血漿cfDNA中表觀遺傳標志物5hmC的分布情況進行檢測，分析5hmC標志物與2型糖尿病血管并發癥發生發展的相關性。結果表明5hmC標志物的變化與T2D合并大血管/微血管事件具有相關性，主要涉及一些與血管生物學和糖尿?。òㄒ葝u素耐受和炎癥反應）相關的基因和信號通路。該研究建立的16個基因-5hmC標志物組合檢測可以準確區分有并發癥和無并發癥的2型糖尿病病人[實驗組：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明顯優于傳統臨床變量例如白蛋白尿。除此之外，還建立了13個基因-5hmC標志物組合檢測，可以進一步區分T2D合并單一并發癥和多種并發癥[實驗組：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同樣明顯優于其他傳統臨床變量。該研究得出結論，5hmC標志物反映了T2D病人大血管/微血管并發癥發生過程中的表觀遺傳變化，因而5hmC-Seal檢測技術在監測糖尿病血管并發癥發生和進展方面具有良好的臨床應用前景。

本研究共納入62例2型糖尿病病人，包括沒有血管并發癥的病人12例，有單一血管并發癥的病人34例（24例發生大血管事件，10例發生微血管事件），以及有多種血管并發癥的病人16例。試驗收集62例病人血漿，提取cfDNA，利用5hmC-Seal技術捕獲外周血cfDNA中的5hmC序列，進行二代測序，通過生物信息學分析找出并發癥組與無并發癥組之間有顯著5hmC修飾差異的基因，單一并發癥組和多種并發癥組之間有顯著5hmC修飾差異的基因。隨后利用回歸模型對差異基因進一步篩選、優化，彈性網絡進一步篩選，計算加權平均分，最后得到一組具有高度靈敏度和特異性的5hmC生物標記物，并進一步在實驗組中驗證，分析其靈敏度和特異性。并將新建立的5hmC標志物基因組合的檢測性能與傳統臨床變量進行對比分析。最后對相關基因進行了信號通路分析和功能探究。

5hmC修飾水平與血管并發癥具有相關性

利用邏輯回歸模型對62例有并發癥和無并發癥2型糖尿病病人的5hmC差異水平進行分析發現，有并發癥2型糖尿病病人的622個差異修飾候選基因（包括上調和下調基因）的歸一化平均數要明顯高于無并發癥的病人（P<0.001），但是單一并發癥和多發并發癥病人之間沒有顯著差異。

之后將有單一并發癥或多種并發癥的50例病人用邏輯回歸模型進行了對比，發現多種并發癥的病人的153個差異修飾候選基因（包括上調和下調基因）的歸一化平均數要低于無并發癥病人（P<0.001）。

5hmC標志物可區分有無并發癥患者

62例2型糖尿病病人被隨機分成訓練組（n=31）和測試組（n=31）。利用彈性網絡篩選后發現，16基因-5hmC標志物組合檢測可以用于區分有并發癥和無并發癥的2型糖尿病病人。

基于16基因組合模型 (Detection Model 1) 的加權平均分分析，發現無并發癥病人的分數在訓練集和測試集中都明顯低于有并發癥的病人。只考慮加權平均分的話，受試者工作特征曲線（ROC）分析表明將cutoff值設置成0.5時，在測試組中中的靈敏度為60%，特異性為100%。

5hmC標志物可區分病人是單一并發癥還是多種并發癥

50例有并發癥的2型糖尿病病人被隨機分成訓練組（n=25）和測試組（n=25）。利用彈性網絡篩選后發現，13基因-5hmC標志物組合可以區分2型糖尿病病人是否發生單一并發癥或多種并發癥。

基于13基因組合模型 (Detection Model 2)， 我們計算了單一并發癥和多種并發癥的加權平均分，發現在訓練集和測試集中單一并發癥和多種并發癥病人的分數都有明顯差異。值得一提的是，有腎病并發癥和無腎病并發癥病人的分數也有明顯差異。利用加權平均分作為判斷標準的受試者工作特征曲線（ROC）表明，在測試組中當將cutoff值設成0.69時，靈敏度為87.5%，特異性為68.8%。

5hmC標志物與傳統臨床變量/危險因子的對比

我們評估了不同臨床變量/危險因子用于監測血管并發癥的靈敏度和特異性（見表1）。

信號通路分析和功能探究

有并發癥和無并發癥病人的135個差異候選基因的功能注釋分析表明，這些基因主要富集在一些經典的信號通路。錯誤發現率相關P值位于前10%和基因數目≥3的信號通路包括由IGF1R, IL-10和FGFR2所介導的信號通路。由IGF1R和IL-10介導的信號通路與胰島素抵抗及炎癥反應相關，在血管生物學和糖尿病發生發展過程中發揮重要作用。

Reactome相互作用網絡的中心表明，泛素編碼基因[泛素B (UBB)，泛素C (UBC)，泛素A-52亞基核糖體蛋白融合產物1(UBA52)]是候選基因（如SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的重要連接者。在這135個差異候選基因中, 一些基因 （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表現出與糖尿病病程相關的傾向，表明5hmC和糖尿病血管并發癥之間可能存在時間依賴性的相互作用?；诳v向時間隊列的大樣本研究，將可進一步明確5hmC變化和糖尿病持續時間之間的動態關聯。關于單一并發癥和多種并發癥病人的159個候選標志基因的功能注釋研究發現，存在細胞-細胞連接、膠原蛋白形成、新陳代謝、細胞應激應答信號通路的富集，這些信號通路均與細胞基本功能密切相關。

血管并發癥是三分之二糖尿病病人的死亡原因，若能及早有效控制血管并發癥的發生，將極大地改善糖尿病病人的生存質量。該研究建立了一種利用cfDNA進行2型糖尿病血管并發癥監測的無創便捷方法，較目前臨床標志物能更準確地監控血管并發癥的發生，從而提示臨床及早采取應對措施，有效控制病情進展。